作為經常上頭條的明星，光遺傳學（optogenetics）和CRISPR這兩個技術的碰撞會產生什么樣的火花？2015年，科學家結合CRISPR和光遺傳學技術，開發出各種光激活的CRISPR工具。這些工具讓研究人員能夠利用光從外部控制基因組編輯過程的地點、時機和可逆性。

從時空上控制轉錄

最初的光激活CRISPR系統于2015年年初發表，側重于利用光來控制轉錄。兩個獨立的實驗室，東京大學的Moritoshi Sato實驗室和杜克大學的Charles Gersbach實驗室，基于光誘導的異源二聚體隱花色素2（CRY2）和整合素結合蛋白1（CIB1），開發出相似的系統。他們的目標是利用光來開啟和關閉基因的表達，同時賦予時空控制和可逆性。

Nihongaki等人開發出的系統是由兩個融合蛋白組成的：1) 基因組錨定物 – 失活的Cas9蛋白（dCas9）與CIB1融合；2) 激活物 – CRY2光裂合酶同源區域（CRY2PHR）與轉錄激活域（VP64或p65）融合。一旦在細胞中表達，在gRNA指引下，dCas9-CIB1與目標DNA序列結合，而CRY2PHR-激活物自由漂浮。在藍光的照射下，CRY2和CIB1二聚化，帶來激活物，激活基因轉錄。

研究人員測試了多種組合來優化融合蛋白。他們發現，表現最好的組合是NLS-dCas9-trCIB1和NLSx3-CRYPHR-p65。在藍光（470nm）的照射下采用狹縫模式，研究人員發現，人ASC1基因的表達可被空間控制。他們還不斷開啟和關閉藍光，發現ASC1的表達也跟著做，說明控制的確是可逆且可重復的。

Polstein等人開發的光激活CRISPR/Cas9效應物（LACE）系統也采用了相似的策略，不過采用了不同的融合蛋白組合。經過優化的LACE系統包括：1) CIBN-dCas9-CIBN，其中CIBN是CIB1的N端片段，與dCas9的N端和C端融合；2) CRY2FL-VP64，全長的CRY2與轉錄激活域VP64融合。在HEK293T細胞中利用此系統來誘導人IL1RN的表達，研究人員發現2小時后mRNA水平提高11倍，30小時后提高400倍。此系統也被證明是可逆的和可重復的。

光活化的基因組修飾

之后，Sato實驗室又推出了光活化系統來切割目標DNA序列，它產生的雙鏈斷裂（DSB）可通過非同源末端連接（NHEJ）或同源定向修復（HDR）來修復。這個系統的獨特之處在于它利用了一種“分裂的”核酸酶。作者將Cas9分成N端（2-713個殘基，N713）和C端（714-1368個殘基，C714）。作者將每個Cas9片段與一個二聚化的結構域相融合，創建了光活化的Cas9工具。

盡管作者嘗試了幾種不同的光活化設計，但他們最成功的設計是利用了磁性光控蛋白，來源于真菌感光體Vivid。這個新系統的昵稱為paCas9-1，包含融合蛋白N713-pMag和nMagHigh1-C714，顯示出低背景和高的誘導活性。與全長的Cas9相比，paCas9-1識別相同的PAM，并有著相似的定位特異性。在藍光的激發下，paCas9-1能通過NHEJ誘導插入缺失（頻率為20.5%），并通過HDR誘導修飾（頻率為7.2%）。

作者還表明，他們能夠通過修改paCas9-1來降低系統的背景活性。他們用nMagC714來取代nMagHigh1-C714，生成了paCas9-2。這種改變并未明顯改變系統生成突變的效率，但降低了背景DSB。與他們之前的工作一樣，Sato實驗室還表明paCas9-2可以在空間上控制，并通過藍光開關來可逆激活。

正如人們所期望的，Nihongaki等人證明，替換融合物中的Cas9結構域，也可以生成光活化的切口酶和抑制物（dCas9）。所有變異體的活性都是可逆且可重復的。

罩住CRISPR

此外，Alexander Deiters的實驗室則采用了一種不同的方法來調控CRISPR。他們利用遺傳編碼的光罩（photocaging）技術，在Cas9蛋白上插入了一個可光去除的保護基團，也就是硝基苯罩住的賴氨酸（PCK）。為了在Cas9的特定位點插入PCK，研究小組使用了吡咯賴氨酰tRNA合成酶，在到達琥珀終止密碼子時加入PCK。

研究人員首先檢驗了罩住Cas9的哪個賴氨酸能夠讓蛋白的切割能力更好地失活，發現是K866賴氨酸。然后，他們利用雙報告基因熒光檢測，證明Cas9 K866PCK突變體的確失活，而用紫外光（365nm）照射后，它顯示出與野生型Cas9同樣的切割活性。最后，研究人員證明，這種光罩Cas9系統能夠讓內源的基因表達沉默。

如今，無論你想激活、抑制或修改基因，你身邊都有工具，通過光來控制基因組編輯。隨著CRISPR和光遺傳學的發展，我們期待未來看到更多更酷的應用。（生物通 薄荷）