生物通報道：基因組測序讓我們意識到，人類基因組只有一小部分被翻譯成蛋白質。其實我們基因組的80%會轉錄成RNA，但這些轉錄本大多不生成蛋白質。近年來人們發現非編碼RNA往往與人類疾病有關，不過絕大多數非編碼RNA的功能還是未知的。

CRISPR/Cas9在這方面可以起到重要的作用。這一系統原本是細菌在漫長進化史中演化出的防御機制，能根據引導RNA的指示，靶標并降解入侵者的遺傳物質。規律成簇的間隔短回文重復CRISPR與內切酶Cas9的組合，可以在引導RNA的指引下，靶標并切割入侵者的遺傳物質。2012年研究者們利用這一特點，將CRISPR系統發展成了強大的基因組編輯工具。

CRISPR/Cas9很快迎來了進一步的改造。研究者們將Cas9帶到特定的基因組位點，通過起始或停止轉錄來調控靶基因的表達。CRISPR激活（CRISPRa）和CRISPR抑制（CRISPRi）就是這樣的技術，它們特別適合分析非編碼RNA的具體功能。雖然越來越多的研究人員開始使用CRISPRa和CRISPRi，但它們其實還剛出爐不久�！拔覀兌际沁@些技術的測試員，”加州大學的Jacob Corn說。

為此，The Scientist雜志聯合CRISPR的開發者和使用者共同編寫了使用CRISPRa和CRISPRi的入門指南，幫助研究者們更好的研究和調節基因組的編碼和非編碼區域。

CRISPRi

CRISPRi技術能抑制指定目標的轉錄，不論是編碼還是非編碼的DNA片段。CRISPRi使用催化失活的Cas9（dCas9），dCas9能到達引導RNA指定的位點，但無力對DNA進行剪切（Cell, 152:1173-83, 2013）。當dCas9結合到基因組的時候，會阻斷轉錄機器的結合，阻止這一過程的進行。

改良版CRISPRi在dCas9上連接了一個來自轉錄沉默子（KRAB）的結構域。這個大約50aa的添加阻礙了DNA伸展，使其難以得到轉錄�！癒RAB結構域的使用目前效果很好，”Corn說。牛津大學的Andrew Bassett也同意這一看法，他認為剛開始接觸CRISPRi的新手應該優先考慮KRAB。雖然它作用于比較大的位點，但抑制效果也更強，更容易被我們觀察到。

CRISPRi的可逆性是一種特色，不過這也限制了該技術的應用。一些研究者正在利用KRAB結構域讓dCas9結合得更加穩定，以實現永久抑制特定位點的轉錄。人們可以通過這種方法研究表觀遺傳學標記的跨代遺傳，Corn指出。

RNAi VS CRISPRi

研究基因功能最常見的方法是，減少或者阻斷基因表達，然后進行表型分析。十多年來，RNAi一直是這一領域的王者，然而新興技術的涌現（尤其是CRISPR技術）正在逐漸瓦解RNAi的統治地位。日新月異的技術發展為生物學研究提供了越來越大的助力，也給研究者們帶來了一個有些糾結的問題，“到底應該選擇那一種技術呢”。

RNA干擾（RNAi）靶標成熟的RNA，而CRISPRi阻止轉錄的起始。如果你的研究核心是轉錄活動而不是RNA產物，那么CRISPRi更有優勢。此外CRISPRi還可以靶標細胞核內的轉錄本，RNAi試劑則很難做到這一點。

RNAi的脫靶效應一直令人擔憂。雖然CRISPR系統也存在脫靶效應，但要比RNAi少得多，因為CRISPRi必須在轉錄起始位點附近才能發揮作用。目前我們對RNAi的問題更為了解，Corn說，因此他的研究團隊仍在使用RNAi。不過Corn相信RNAi未來難免會江河日下。

未完待續

Molecular Cell雜志技術特刊的一篇文章對RNAi、TALEN和CRISPR這三大工具進行了全面比較，為基因功能研究提供了一份實用指南。研究者們可以根據自己的需要，簡單直觀的找到最適合自己的技術�，F在這篇文章可以免費下載（更多詳細信息參見：CRISPR、RNAi、TALEN一張圖教你做出正確選擇）

RNAi比較容易出現錯誤，siRNA/shRNA的脫靶效應會引起假陽性結果，siRNA/shRNA缺乏活性會引起假陰性結果。此前，加州大學舊金山分校的研究團隊通過建立超復雜混合shRNA文庫（ultracomplex pooled short-hairpin RNA libraries），在很大程度上克服了RNAi用于全基因組篩選時的脫靶效應�，F在他們通過系統改良進一步增強了shRNA的活性，向人們展示了靶標人類和小鼠基因組的新一代shRNA文庫。（更多詳細信息參見：與CRISPR旗鼓相當的新一代RNAi ）

CRISPR-Cas9在醫療領域有著廣闊的前景，可以用來矯正致病突變，治療人類疾病。研究者們也在嘗試用這一技術操縱生態群體，比如根據毒力或者抗性基因殺死相應的細菌、快速改變種群性狀、控制入侵物種、改良主要農作物等等。此外，CRISPR-Cas9還有著很大的潛力，可以被改造為更強大的研究工具。加州大學伯克利分校的Jennifer A. Doudna在Molecular Cell雜志上發表文章，全面探討了CRISPR-Cas9在各方面的應用。Doudna是CRISPR技術的共同開發者，曾因這一技術獲得了“生命科學突破獎”（Breakthrough Prize），也是CRISPR專利的有力競爭者。（更多詳細信息參見：CRISPR只是基因組編輯？你已經OUT了）