CRISPR/Cas9的出現使得人們能夠高效地開展精確而靶向的基因組修飾。這其中的關鍵組分Cas9經過修飾，能夠敲除、活化、抑制甚至是成像你感興趣的基因。不過，目前有這么多種Cas9可供選擇，你一定又開始犯愁。別急，讓Addgene的專家來幫幫你。

首先，讓我們來想想實驗的目的吧。你希望永久敲除一個基因，還是希望降低特定基因的表達，而并非永久性地修飾基因組？激活特定位點是不是更有意義？還是，修飾表觀基因組？這些問題的答案將決定了你的實驗需要哪種Cas9。

基因敲除選哪個？

標準的SpCas9

通過共表達目的基因特異的gRNA和核酸內切酶Cas9可創建敲除的細胞或動物�；�因組目標可被任何~20個核苷酸的DNA序列靶定，前提是它滿足兩個條件：1) 序列在基因組中是獨特的；2) 目標在間隔相鄰基序（PAM）的上游。當基因組中有適合的目標位點，并且不太在意脫靶效應時，SpCas9是合適的選擇。

關心特異性？

設計適當的gRNA序列，能增強Cas9介導的切割的特異性。不過，人們也利用多種方法來進一步增強Cas9的特異性。例如，Cas9通過兩個核酸酶結構域RuvC和HNH來產生雙鏈斷裂，Cas9-nickase（Cas9n）就利用了這一點。它將兩個關鍵殘基中的一個轉換成丙氨酸（D10A或H840A），形成了Cas9切刻酶。目標位點上需要兩個正確識別的Cas9n分子，才能產生雙鏈斷裂，這與野生型SpCas9相比大大增強了特異性。

盡管Cas9n無疑比SpCas9更加特異，但它仍然可能與脫靶位點結合，導致插入缺失。為了克服這個限制，人們使用失去核酸酶活性的Cas9（dCas9），將其與非特異性的內切核酸酶FokI融合。FokI只在二聚化時切割目標DNA。因此，只有當兩條dCas9-FokI分子正確靶定目標序列，切割才會發生。

Cas9n或dCas9-FokI方法的一個明顯局限在于它們都需要兩個適當的目標序列足夠靠近，才能有效地產生雙鏈斷裂。一些實驗室則利用結構生物學來鑒定Cas9切割脫靶位點的關鍵殘基，包括Broad研究院的張鋒實驗室和麻省總醫院的Keith Joung團隊。與野生型的SpCas9相比，“增強型Cas9”（張鋒）或“高保真Cas9”（Joung）的切割活性相當，但脫靶活性大大降低。

基因活化選哪個？

Cas9的獨特之處在于它結合DNA的能力和切割DNA的能力是獨立的。換句話說，即使切割DNA的能力被破壞掉，它仍然能夠與目標DNA結合。此外，失去核酸酶活性的Cas9（dCas9）可作為一個平臺，向特定的DNA位點帶去不同的貨物。這種特性把各種蛋白帶給目的基因，包括轉錄激活因子和抑制因子。

抑制目的基因

早期使用dCas9的實驗已表明，讓dCas9針對轉錄起始位點就足以“壓制”轉錄。不過，在哺乳動物的細胞中，需要讓帶有轉錄抑制因子的dCas9靶定目的基因的啟動子區域，才能實現可靠的抑制。如果目的基因的敲除對細胞有毒性，那么你可能需要考慮基于dCas9的抑制，包括dCas9-KRAB。Addgene提供多種質粒，抑制各個物種和細胞類型中的目的基因。

活化目的基因

基于dCas9的激活因子卻是完全不同的。最簡單的激活因子是指dCas9與單個轉錄激活域（通常是VP64）相融合。最近，第二代的激活因子也被開發出來，利用不同的方法改變基因表達。例如，“SunTag”系統通過dCas9和抗體活化融合蛋白的共表達，將多個激活域招募到同一個基因位點。Synergistic Activation Mediator復合物則包含dCas9-VP64融合和修飾的gRNA，后者能夠與其他的RNA-結合轉錄激活因子相互作用。

下一步做什么？

如果你已經選擇了適當的Cas9，恭喜你！下一步做什么呢？這里有一些注意事項，也許對你的CRISPR實驗有幫助。

設計或選擇一個gRNA – 對于你感興趣的目的基因，一些公司提供了經過驗證的gRNA。這些gRNA已經成功應用在實驗中，并發表在同行評審的期刊上，在你剛開始著手CRISPR實驗時，它們能節省不少的時間和成本。如果你的實驗需要新的gRNA，那么可以選擇空的gRNA載體，并利用免費的gRNA設計程序設計你的gRNA靶向序列。

不過，選擇適當的Cas9只是實驗成功的一半，你還需要選擇適當的表達系統，并將Cas9導入目的細胞。目前市場上有各種含Cas9的質粒，可用于不同物種的表達，包括細菌、酵母、植物和哺乳動物等。對于難轉染的細胞，你可能需要考慮用慢病毒將Cas9導入細胞內。當然，導入mRNA和蛋白質也是另一種選擇。

驗證你的基因組編輯 – 一旦將Cas9和gRNA導入細胞，現在是時候確認你的目標序列是否得到了修飾。具體操作可能有所不同，這取決于特定的實驗。之后我們會詳細介紹。（生物通 薄荷）